Recipes

====== dnpshop ====== Новый метод, пригодный для скрининга лекарств. Данный метод подходит для тестирования воздействия веществ на митохондрии, в частности, для тестирования токсического или полезного действия лекарственных соединений или кандидатов в лекарственные препараты. Данный метод ориентирован на проведение измерений ex vivo в митохондриях человеческого организма, но в условиях, максимально приближенных к условиям in vivo. Метод также подходит для исследования влияния веществ на митохондриальное дыхание. Указанный метод применим для i) скрининга и проведения отбора на начальной или поздней стадии исследования кандидатов в лекарственные препараты на клеточном уровне, выделенных из организма здоровых людей, или в так называемом лейкотрофоцитарном слое, содержащем концентрированный раствор тромбоцитов и палевых клеток крови, ii) исследования чувствительности человека к известному митохондриальному токсиканту, iii) анализа митохондриальной токсичности стройным персоналом в соответствии с медицинскими экспериментами и/или iv) анализа благоприятного воздействия лекарственных препаратов, предназначенных для улучшения митохондриальной функции. 2420-523147ea/030 скрининг на митохондриальную токсичностьисследование техники, к которой относится изобретение настоящее изобретение относится к новому методу, который подходит для скрининга лекарственных средств. А именно, данный метод подходит для тестирования воздействия веществ на митохондрии, в частности, для тестирования токсического или положительного воздействия лекарственных средств или кандидатов в лекарственные средства. Данный метод основан на измерениях ex vivo в спорулированных митохондриях человека, которые, однако, значительно приближены к условиям in vivo. Данный метод также подходит для исследования влияния веществ на митохондриальное дыхание. В последние годы некоторые из новых препаратов, одобренных fda, впоследствии были отозваны из-за токсических эффектов, таких как кардио- или гепатотоксичность. Так, из новых препаратов, одобренных fda в период с 1994 по 2006 год, 38 препаратов были отозваны из-за токсических манипуляций с печенью и сердцем, что считается типичным симптомом митохондриальной токсичности. Безусловно, эти новые препараты перед одобрением проходили стандартные испытания на токсичность, а токсические эффекты наблюдались только после использования препаратов в лечении чрезмерного количества пациентов. Как отмечают dykens & will (2007), данные свидетельствуют о том, что митохондриальная дисфункция сыграла определенную роль в определении токсичности различных препаратов, которые были отозваны с рынка и возвращены на него только со строгими ограничениями. Кроме того, функция митохондрий в последние годы вызывает большой интерес, и принято считать, что митохондриальная дисфункция является важным фактором в патогенезе большого числа заболеваний (таких, например, как мышечные повреждения, нейропатия, кардиомиопатия, энцефалопатия, полиорганная недостаточность, вызванная сепсисом). В настоящее время митохондриальная токсичность кандидатов в лекарственные препараты оценивается в основном на животных и клеточных культурах, и полученные результаты трудно перенести на будущее применение препаратов для человека. Таким образом, существует необходимость в разработке чувствительного, воспроизводимого, надежного и простого теста митохондриальной токсичности, который можно было бы использовать для тестирования при разработке лекарственных препаратов. Описание объекта изобретения настоящее изобретение преимуществом разработанного метода является определение токсичности лекарственного средства (или положительного эффекта лекарственного средства) в живых митохондриях человека ex vivo, но в условиях, максимально приближенных к условиям in vivo. Компоненты крови человека, содержащие митохондрии (лейкоциты и/или тромбоциты), исследуются в плазме, что обеспечивает условия, очень близкие к условиям in vivo. Таким образом, учитываются все факторы, такие как буферная емкость, сывороточный альбумин, электролиты, гидролизующие ферменты и т.Д. Новый метод позволяет напрямую оценить токсические концентрации в крови человека, что невозможно при исследовании на клеточных культурах или животных, которые используются в настоящее время. Таким образом, скрининг и исследование лекарственных препаратов на токсичность для человека можно проводить на гораздо более ранних стадиях, чем это возможно в настоящее время. В свою очередь, данный метод позволит отсеивать токсичные лекарственные кандидаты на более ранних стадиях, избегая тем самым многочисленных испытаний на животных и болезненных последствий для человека в будущем. Данный метод будет способствовать скринингу лекарственных кандидатов на более ранней стадии, тем самым сокращая общее время и стоимость разработки лекарственных препаратов. Данный метод может быть использован с различными параметрами установки и с изменением параметров установки в зависимости от целей метода. Таким образом, не ограничивая область применения, метод согласно настоящему изобретению может быть использован для: 1. Скрининга и проведения ранней или поздней стадии отбора кандидатов в лекарственные препараты в клетках, выделенных из крови здоровых людей, или в так называемом лейкотрофоцитарном слое, представляющем собой концентрированный раствор тромбоцитов и лейкоцитов. 2. Исследования чувствительности пациента к известному митохондриальному токсиканту. 3. Анализа митохондриальной токсичности препарата в условиях клинического исследования. 4. Анализ благоприятного действия лекарств агентов, направленных на улучшение митохондриальной функции. Подходящий метод для скрининга и отбора потенциальных лекарств или для исследования чувствительности человека к веществу, влияющему на митохондрии (т.Е, метод согласно пунктам 1 и 2 выше), представляет собой метод, включающий: i) спирометрию высокого разрешения образца клеток, которые содержат живые митохондрии, выделенные из образца крови человека, ii) контакт образца клеток с веществом, которое увеличивает проницаемость внутренней мембраны митохондрий по отношению к протонам, (iii) добавление тестового образца, содержащего тестовое вещество в носителе, (iv) сравнение потребления кислорода до и после добавления тестового образца и сравнение потребления кислорода в тестовом образце с потреблением кислорода в контрольном образце носителя, где снижение потребления кислорода указывает на негативное воздействие на митохондрии, (v) контактирование образца из (iii) с ингибитором функции митохондриального комплекса i, таким как ротенон, с целью выявления клеточного дыхания, зависящего от окисления субстрата комплекса ii, (vi) контакт образца из (v) с ингибитором функции митохондриального комплекса iii, таким как антимицин а, для выявления любой активности, отличной от потребления кислорода митохондриями, такой как аутоксидация образца. Альтернативная методика скрининга и отбора потенциальных лекарственных средств или исследования чувствительности человека к веществу, воздействующему на митохондрии (т.Е, метод согласно пунктам 1 и 2 выше) включает в себя тестирование действия такого вещества в скрининговом анализе комплекса ii. Такой метод проиллюстрирован на фиг. 11, и включает: i) спирометрию высокого разрешения образца клеток, которые содержат живые митохондрии, выделенные из образца крови человека, ii) контакт образца клеток с веществом, которое ингибирует дыхание комплекса i, iii) добавление тестового образца, содержащего исследуемое вещество в носителе, iv) добавление вещества, пермеабилизирующего цитоплазматическую мембрану, v) добавление стандарта к образцу, полученному согласно пункту iv), vi) добавление вещества, ингибирующего дыхание комплекса iii. Результаты, полученные в ходе исследований, сравниваются с результатами, полученными методом, в котором используемое тестовое вещество идентично эталонному. Типичный результат представлен на фиг. 11, из которого видно, что препарат-кандидат способен проникать через цитоплазматическую мембрану в определенной степени (т.Е. Обеспечивается усиление дыхания). Добавление дигитонина, который делает цитоплазматическую мембрану проницаемой, не приводит к дальнейшему усилению дыхания, т.Е. Не усиливает действие испытуемого вещества. При добавлении эталонного вещества (субстрата, связанного с комплексом ii, например сукцината), которое обычно является эндогенным субстратом, например сукцинатом, наблюдается увеличение дыхания и достигается максимальная активность. Затем добавляют комплекс iii, например антимицин а, для определения активности, не связанной с потреблением кислорода митохондриями, например автоокисления данного образца. При сравнении с результатами для эталонного вещества, которое является эндогенным субстратом, например сукцинатом, видно, что эталонное вещество не проникает через цитоцитоплазматическую мембрану. Только при пермеабилизации мембраны, например, дигитонином, дыхание увеличивается. Дальнейшее добавление эндогенного вещества не изменяет дыхания, а добавление ингибитора комплекса iii останавливает митохондриальное дыхание. Очевидно, что картина, наблюдаемая для исследуемого вещества, может отличаться от представленной на рис. 11. Метод дает ценную информацию о том, может ли тестируемое вещество проникать через цитоплазматическую мембрану и положительно влиять на активность митохондрий, связанную с потреблением кислорода (т.Е. Увеличивать митохондриальное дыхание по комплексу ii). Таким образом, наиболее близкое к идеалу испытуемое вещество будет иметь уровень a, превышающий a', при этом a будет приближаться к уровню b'. Более подробная информация приведена в данном описании в примерах. Другой подход заключается в изучении влияния испытуемого вещества на дыхание комплекса i, комплекса ii и/или комплекса iv. Изучение дыхания комплексов i, ii и/или iv позволяет получить более подробную информацию о влиянии конкретного вещества на митохондриальное дыхание и оценить положительное или отрицательное воздействие на митохондриальную функцию. На фиг. 14 показано влияние возрастающих концентраций метформина на митохондриальное дыхание комплексов i, ii и iv. Рисунок показывает специфическую дисфункцию дыхания комплекса i при увеличении концентрации метформина, в то время как дыхание комплексов ii и iv, по-видимому, не затрагивается. Дыхание комплекса i (oxphosci) стимулируется после добавления adp с последующим добавлением дополнительного глутамата, который является субстратом комплекса i (см. Рис. 3). Дыхание комплекса ii стимулируется при добавлении в образец клеток ингибитора комплекса i (в частности, ротенона) с последующим добавлением возрастающих количеств тестируемого вещества. Дыхание комплекса iv стимулируется при добавлении n,n,n',n'-тетраметил-п-фенилендиамина (тмпд, 0,5 мм), донора электронов комплекса iv. В связи с высокой степенью автоокисления тмпд добавляют азид натрия (10 мм), ингибитор комплекса iv, и по разнице между двумя полученными уровнями рассчитывают удельную активность комплекса iv. Подходящий метод для исследования воздействия на митохондрии препаратов-кандидатов в клинических испытаниях или курсах лечения (т.Е. В соответствии с пунктами 3 и 4 выше) включает: i) спирометрию высокого разрешения образца клеток, содержащего живые митохондрии, выделенного из образца крови человека, при этом образец клеток человека получен от человека, участвующего в клиническом испытании или проходящего курс лечения, а испытуемое вещество вводится человеку в рамках клинического испытания или в соответствии с курсом лечения, (ii) контакт образца клетки с веществом, которое увеличивает проницаемость внутренней митохондриальной мембраны для протонов, (iii) сравнение потребления кислорода образца, полученного от индивидуума, участвующего в клиническом исследовании или (ii) проходящего курс лечения, (iii) сравнение потребления кислорода образца, полученного от индивидуума, участвующего в клиническом исследовании или (ii) проходящего курс лечения, с потреблением кислорода контрольного образца, полученного от контрольной группы, причем снижение потребления кислорода указывает на негативное воздействие на митохондрии, (iv) контакт образца, полученного согласно (iii), с ингибитором функции митохондриального комплекса i, таким как ротенон, (v) контакт образца, полученного в соответствии с (iv), с ингибитором функции митохондриального комплекса iii, таким как антимицин а, для выявления любой активности, отличной от потребления кислорода митохондриями, такой как автоокисление указанного образца. Как видно из вышесказанного, методы по существу идентичны и отличаются только исследуемыми образцами, т.Е, т.Е. Являются ли эти образцы тестовыми веществами или образцами клеток человека, участвующего в клиническом исследовании или проходящего лечение. Человек, участвующий в клиническом исследовании или проходящий курс лечения, получает исследуемое вещество, лекарственный препарат или потенциальное лекарственное вещество в соответствии с клиническим исследованием или курсом лечения. Это означает, что митохондрии, выделенные из образца крови, взятого у такого человека, подвергаются воздействию рассматриваемого лекарственного вещества или потенциального лекарственного вещества, и, таким образом, с помощью метода настоящего описания можно наблюдать любое влияние указанного вещества на митохондриальное дыхание. Митохондриальное дыхание контролируется с помощью спирометрии. Соответствующие настройки указаны в примерах, приведенных в настоящем описании, но специалист в данной области знает, как изменить или скорректировать настройки при необходимости или в случае использования другого прибора. Образец крови может представлять собой образец венозной крови. Тромбоциты, лейкоциты или их комбинации могут быть выделены и использованы. Подходящие примеры веществ, увеличивающих проницаемость внутренней митохондриальной мембраны для протонов, включают п-(трифторметокси)фенилгидразон карбонилцианид (fccp), м-хлорфенилгидразон карбонилцианид (ссср), 2,4-динитрофенол (dnp) или другие протонофоры. Дополнительные сведения о методах приведены в примерах настоящего описания и в прилагаемой формуле изобретения. Ниже приведены подробности описанных методов. 1 . Скрининг и выбор кандидатов на ранней и последней стадиях лекарственных препаратов в клетках, выделенных из крови здоровых людей, или в таком названии лейкотромбоцитарный слой, который является концентрированной растворкой тромбоцитов и клеток белой крови такой метод включает: i) спирометрия высокого разрешения образца клеток, содержащих живые митохондрии, выделенных из образца венозной крови человека, при концентрации кислорода от 400 до 25 мкм og и постоянной температуре 37°c, ii) контакт образца клеток с веществом, увеличивающим проницаемость внутренней мембраны митохондрий по отношению к протонам, например, карбонилцианид п- (трифторметокси)фенилгидразон (fccp), карбонилцианид м- хлорфенилгидразон (ссср), 2,4-динитрофенол (dnp) или другой протонофор, для того чтобы максимально повысить активность митохондриальной системы переноса электронов, присутствующей в тромбоцитах, (iii) добавление тестового образца, содержащего тестовое вещество на носителе; добавление обычно проводят, постепенно увеличивая дозу над добавляемым носителем, (iv) сравнение потребления кислорода до и после добавления тестового образца и сравнение потребления кислорода между тестовым веществом и носителем, причем снижение потребления кислорода указывает на отрицательное воздействие на митохондрии, (v) контакт образца, полученного в соответствии с (iii), с ингибитором функции митохондриального комплекса i, таким как ротенон, для определения клеточного дыхания, зависящего от окисления субстрата комплекса ii, vi) контакт образца, полученного согласно v), с ингибитором функции митохондриального комплекса iii, таким как антимицин а, для определения любой активности, отличной от потребления кислорода митохондриями, такой как автоокисление указанного образца. Снижение может быть значительным или дозозависимым. Как описано выше, образец крови человека получают от здоровых людей. Как правило, образец получают, как описано в примерах настоящего описания. Клетки обычно представляют собой тромбоциты, лейкоциты или их комбинации. Клетки могут быть суспендированы в плазме крови человека (в некоторых случаях в собственной плазме) или в водном буферном растворе, содержащем, в частности, сахарозу, hepes, k-лактобионат, хлорид магния, дигидрофосфат калия, egta и бычий сывороточный альбумин, или в других подходящих буферных растворах. Ph обычно регулируется в диапазоне от 7,0 до 7,5, в частности, доводится до 7,1. Как правило, для нативных тромбоцитов или лейкоцитов предпочтительно растворение в плазме крови, чтобы наилучшим образом имитировать ситуацию in vivo. Однако в некоторых ситуациях или в качестве дополнения к растворению в плазме можно использовать фосфатно-буферный солевой раствор, дополненный 5 мм глюкозы (можно использовать для сравнения с сериями анализов, проведенных в плазме), или буферный раствор, более похожий на внутриклеточный раствор, содержащий промежуточные продукты цикла кребса для пермеабилизированных тромбоцитов или лейкоцитов. Внутриклеточный буферный раствор используется для пермеабилизированных тромбоцитов (и лейкоцитов) и при наличии субстратов митохондриального дыхания в избытке (в насыщающих количествах), чтобы максимизировать перенос электронов и увеличить разрешение анализа. Клетки, полученные из образца крови человека, могут быть проанализированы как нативные или пермеабилизированные. В зависимости от того, нативные или пермеабилизированные тромбоциты или лейкоциты, могут быть использованы различные экспериментальные методики (методика suit - титрование субстрат-субстрат-ингибиторной изоляции). Как правило, используются нативные тромбоциты или лейкоциты. Пермеабилизированные тромбоциты или лейкоциты используются для того, чтобы за один эксперимент собрать как можно больше информации об активности различных дыхательных комплексов. Тромбоциты пермеабилизируют путем воздействия на них дигитонином или другими веществами, которые делают цитоплазматическую мембрану клеток проницаемой для субстратов и адф. В качестве других веществ могут выступать сапонин или triton-x. Как видно из примеров, приведенных в данном описании, оптимальная доза дигитонина составляет 1 мкг/лхло6 тромбоцитов. Клетки обычно суспендируются в стеклянной камере прибора в концентрации от 200х106/мл до 400х106/мл. Испытуемый образец может быть добавлен несколько раз в возрастающих концентрациях для определения минимальной концентрации, оказывающей негативное воздействие на митохондрии (т.Е. Вызывающей токсический эффект). Начальная и конечная концентрации испытуемого вещества зависят от его силы, но обычно находятся в диапазоне от субмикромолярных до миллимолярных концентраций. Таким образом, данный метод может быть использован для определения того, какие дозы безопасны, а какие нет, и использования каких, соответственно, следует избегать. Данный метод также может быть использован для сравнения двух или более препаратов или кандидатов в препараты друг с другом с целью определения того, какие препараты или кандидаты в препараты безопасны для использования. Данный метод также может быть использован для сравнения двух или более лекарственных средств или кандидатов в лекарственные средства друг с другом, чтобы определить, какие лекарственные средства или кандидаты в лекарственные средства безопасны для использования. Данный метод также может быть использован для сравнения двух или более лекарственных средств или кандидатов в лекарственные средства друг с другом, чтобы определить, какие лекарственные средства или кандидаты в лекарственные средства безопасны для использования таким образом, указанный метод повторяется с другим(и) исследуемым(и) веществом(ами) и полученные результаты сравниваются. То вещество, которое дает наименьшее снижение дыхания по сравнению с нормальным уровнем, является безопасным с точки зрения токсического действия на митохондрии на рис. 7-9 представлен результат такого сравнения. На рис. 7 представлены результаты двух экспериментов с противодиабетическими препаратами, в одном из которых титровался препарат троглитазон, а в другом - росиглитазон. Из рис. 7 видно, что росиглитазон является более безопасным препаратом, чем троглитазон, с точки зрения митохондриальной токсичности. Троглитазон больше не продается из-за его токсического действия. На рис. 8 представлены результаты двух экспериментов с использованием миноциклина и доксициклина, которые показывают, что доксициклин безопаснее миноциклина. На рис. 9 представлены результаты двух экспериментов с использованием церивастатина и симвастатина, которые показывают, что симвастатин более безопасен, чем церивастатин. Действительно, церивастатин уже снят с производства, а симвастатин остается на рынке. Для повышения активности митохондриальной системы переноса электронов в тромбоциты добавляют карбонилцианид п-(трифторметокси)фенилгидразона (fccp) или другое вещество, увеличивающее проницаемость внутренней мембраны митохондрий для протонов. Как видно из примеров, приведенных в настоящем описании, концентрация в диапазоне от примерно 5 до примерно 100 мкм дает подходящий ответ. Если для растворения тромбоцитов в таблетке используется плазма, то оптимальная концентрация составляет примерно 100 мкм с подходящим диапазоном от примерно 50 до примерно 200 мкм, а если используется фосфатный забуференный солевой раствор (pbs), то оптимальная концентрация низкая, в частности примерно б мкм с диапазоном от примерно 2 до примерно 2 0 мкм. В подходящий момент времени после добавления тестируемого вещества (например, от 1 до 10 мин) последовательно добавляют ингибитор комплекса i (ci), например ротенон, и ингибитор комплекса iii (ciii), например антимицин-а, для ингибирования системы переноса электронов (ets) с сохранением остаточного, немитохондриального потребления кислорода, которое вычитается из различных параметров дыхания в дальнейших анализах. Данная процедура позволяет оценить специфику митохондриального дыхания, а также выявить самоокислительные свойства исследуемых соединений. Ротенон добавляют в количестве, соответствующем конечной концентрации в образце около 2 мкм, в диапазоне от 1 до 5 мкм. Если используется другой ингибитор комплекса i, то его конечная концентрация должна быть такой, чтобы получить тот же эффект, что и при использовании ротенона. Антимицин-а добавляется в количестве, соответствующем конечной концентрации в образце около 1 мкг/мл, в диапазоне от около 0,1 до около 10 мкг/мл. Если используется другой ингибитор комплекса iii, то значение конечной концентрации должно быть таким, чтобы обеспечить тот же эффект, что и при использовании антимицина-а. Антимицин-а всегда добавляют после ротенона, чтобы определить активность комплекса ii после ингибирования комплекса i. Детали экспериментов становятся понятными из примеров и формулы изобретения. 2. Тестирование чувствительности пациента к знакомым митохондриальным токсикантам в настоящее время известно и используется множество известных митохондриальных токсикантов. Однако прежде чем начать медикаментозное лечение, врач должен знать, чувствителен ли пациент к этим препаратам. Одним из примеров является широко используемый противоэпилептический препарат вальпроевая кислота, которая может вызывать серьезные повреждения мозга или печени, если назначается не тем пациентам. Способ по существу аналогичен описанному выше в п. 1). Указанный метод включает в себя: i) спирометрию высокого разрешения клеток, содержащих живые митохондрии, выделенных из образца венозной крови человека, при концентрации кислорода в диапазоне 400-25 мкм ог и при постоянной температуре 37°c, ii) контакт образца клеток с карбонилцианидом п-(трифторметокси)фенилгидразона (fccp) или другим веществом, которое увеличивает проницаемость внутренней митохондриальной мембраны для протонов, чтобы максимизировать активность митохондриальной электрон-транспортной системы, присутствующей в тромбоцитах, iii) добавление тестового образца, содержащего указанное вещество в носителе, с постепенно увеличивающейся дозой, по сравнению с добавленным носителем, (iv) сравнение потребления кислорода до и после добавления образца, причем снижение потребления кислорода указывает на негативное воздействие на митохондрии, (v) контакт образца согласно (iv) с ингибитором функции митохондриального комплекса i, таким как ротенон, для того чтобы, для выявления клеточного дыхания, зависящего от окисления субстрата комплекса ii, vi) контактирование образца согласно v) с ингибитором функции митохондриального комплекса iii, таким как антимицин а, для выявления любой активности, отличной от потребления кислорода митохондриями, такой как автоокисление указанного образца. Как используется в настоящем документе, образец крови человека берется у пациента, который может получать специфическое лечение конкретными препаратами или кандидатами в препараты, а тестовый образец содержит конкретный препарат или кандидат в препараты. Как описано в (1) выше, тестовый образец может быть введен несколько раз в возрастающих концентрациях с целью выявления минимальной концентрации, которая оказывает негативное воздействие на митохондрии (т.Е. Вызывает токсический эффект), оказывает токсическое действие). Начальная и конечная концентрации испытуемого вещества зависят от его силы, но обычно в 10 раз превышают переходные или устойчивые уровни, чтобы учесть накопление препарата в тканях. Таким образом, данный метод может быть использован для определения того, какие уровни доз безопасны, а какие нет, и, следовательно, каких доз следует избегать. надежные результаты. При концентрации 50х106 тромбоцитов/мл абсолютное потребление кислорода составляет всего около 25 нмоль/мл за весь эксперимент. Состояние дыхания не изменяется при оценке в различных концентрациях, заисключением etsci+n, которое несколько снижается при 50х106 тромбоцитов/мл. Причина этого не вполне понятна, но максимальный эффект fccp и его влияние на неспецифическое связывание с другими клеточными мембранами могут быть изменены при более низком содержании клеток, даже если титрование проводится тщательно. Сила этого метода заключается в возможности сочетать анализ как нативных, так и пермеабилизированных тромбоцитов. Анализ нативных клеток, взвешенных в собственной плазме, включает экспериментальные инфузии, которые, вероятно, очень похожи на физиологические условия. Это позволяет изучать не только врожденные генетические дефекты, но и митохондриальные дефекты, вызванные экзогенными факторами, такими как токсины или лекарственные препараты. Дополнительная информация может быть получена из пермеабилизированных клеток, где с помощью различных методов титрования (suit) можно регулировать поток к различным частям дыхательной системы, чтобы выяснить, где находится патология. Хотя спирометрия может рассматриваться как один из предпочтительных способов оценки биоэнергетической функции митохондрий (brand and nicholls, 2011), а митохондрии тромбоцитов, вероятно, являются хорошим источником жизнеспособных митохондрий человека, этот метод имеет свои недостатки. Заболевания, поражающие митохондрии, могут быть более или менее тканеспецифичными, а мутации в мтднк, как известно, проявляются в разных тканях в разных соотношениях, что известно как гетероплазмия. Таким образом, изменения могут остаться нераспознанными, если они не присутствуют в значительном количестве в анализируемой ткани. Клетки обладают способностью компенсировать снижение уровня атф и обычно имеют порог, при котором компенсация уже невозможна и происходит отказ органа (rossignol et al. 2003). Таким образом, трудно предсказать, на каком уровне снижение митохондриального дыхания следует считать патологическим. Тем не менее, все вышеперечисленные недостатки не являются уникальными для данного метода, а существуют независимо от того, какая ткань или методика используется. В методике титрования настоящего изобретения авторы не включают специфические измерения комплекса iv, который обычно образуется с использованием искусственного донора электронов tmpd в сочетании с аскорбиновой кислотой для поддержания tmpd в восстановленной форме. Тмпд/аскорбат подвергается автоокислению , катализируемому различными металлсодержащими белками (например, цитохромом с), а также зависит от концентрации кислорода. В связи с тем, что авторы настоящего изобретения использовали метод пробоподготовки, количество неспецифического клеточного вещества и плазмы является переменным, и поэтому невозможно сделать какие-либо фоновые поправки на автоокисление тмпд/аскорбата. Заключение измерения дыхания тромбоцитов хорошо подходят для изучения митохондрий человека в физиологических условиях ex vivo. Показано, что надежные результаты могут быть получены для небольших объемов образцов и после хранения до 24 ч с помощью спирометрии высокого разрешения. Применяя различные методики suit, можно получить подробную информацию о клеточной дыхательной активности и различиях между разными экспериментальными группами, и авторы настоящего изобретения описывают, как оценить эти результаты. Данный подход может быть пригоден для оценки как экзогенных, так и эндогенных митохондриальных нарушений, и в настоящее время авторы настоящего изобретения проводят оценку способа согласно настоящему изобретению для решения указанных проблем. Рисунки к рисункам рис. 1. Типичная кривая титрования дигитонина. Тромбоциты с концентрацией 10 0 0*106/мл суспендируют в буфере mir05, изначально содержащем 5 мм сукцината и 1 мм адф. После стабилизации в нормальных условиях дыхание комплекса i ингибируется ротеноном с последующим ступенчатым (20 мкг) титрованием дигитонином до тех пор, пока не будет обнаружено дальнейшее увеличение рис. 2. Процедура эксперимента для нативных тромбоцитов. Эндогенное (нормальное) дыхание сопровождается индукцией комплекса v (leak)-независимого дыхания с помощью олигомицина (1 мкг/мл). Максимальное дыхание достигается титрованием протонофора - карбонилцианида п- (трифторметокси)фенилгидразона (fccp со средней концентрацией б мкм в pbs или 100 мкм в плазме), затем титрованием ротенона (2 мкм) и антимицина- a (1 мкг/мл), ингибирующих комплекс i и комплекс iii соответственно, для измерения остаточного потребления кислорода. Индуцированные состояния дыхания и используемые дыхательные субстраты указаны над графиком. Ets = electron transfer system. Рис. 3. Процедура эксперимента для пермеабилизированных тромбоцитов. Экспериментальная кривая, отражающая скорость потребления кислорода, получена с использованием метода титрования субстрат-дисассоциаторного ингибитора. Над графиком указаны индуцированные состояния дыхания и активированные дыхательные комплексы. Тромбоциты пермеабилизировали дигитонином и одновременно добавляли субстрат комплекса i (ci) малат и пируват (5 мм, соответственно). Затем окислительное фосфорилирование (oxphos) стимулируется добавлением adp (1 мм) с последующим добавлением субстрата комплекса i - глутамата (5 мм). Добавление сукцината (10 мм), связанного с комплексом ii (si), обеспечивает конвергентный вход электронов как через комплекс i, так и через комплекс ii. Oxphos ингибировалась олигомицином (1 мкг/мл), что свидетельствует о независимости дыхания от комплекса v (leak). Максимальная дыхательная активность системы переноса электронов (ets) индуцируется титрованием протонофора, карбонилцианида п- (трифторметокси)фенилгидразона, (fccp, средняя концентрация b мкм) ). Ингибирование комплекса i ротеноном (2 мкм) показывает, что дыхание поддерживается комплексом ii. Остаточное, отличное от митохондриального, потребление кислорода обнаруживается при добавлении ингибитора комплекса iii антимицина-а (1 мкг/мл). Добавление тмпд (0,5 мм) и азида (10 мм) не показано. Индуцированные состояния дыхания и используемые дыхательные субстраты указаны над графиком. Рис. 4. Корреляция возраста и пола с митохондриальным дыханием тромбоцитов. A, корреляция между нормальным дыханием и возрастом, отдельные точки - среднее из двух повторных значений. B. Корреляция между дыханием etscii и возрастом и c. Корреляция между дыханием oxphosci+ii и возрастом. D. Сравнение дыхания etsci+ii между полами. Определение дыхательных состояний см. На рис. 3. Рис. 5. Влияние концентрации тромбоцитов на различные состояния дыхания в пермеабилизированных тромбоцитах. Потребление кислорода при различных состояниях субстрата, метод титрования в диапазоне концентраций от 50 до 400*106 тромбоцитов/мл. Определение дыхательных состояний см. Рисунок 3. N=5, каждый эксперимент проводится дважды, *=p b означает, что a больше b a> > b означает, что a значительно больше b a^-b означает, что значение a приближается к значению b рекомендуемые свойства составителя: максимальное значение достигается при низкой концентрации препарата. A "a' a^b' a^b' c^c' d-> d' соединения, не способные проникать через клеточную мембрану, идентифицируются в анализе как: a^a' немитохондрий-ассоциированное потребление кислорода, индуцированное лекарственным кандидатом, идентифицируется, когда d> d' references baumgartl, h. Lubbers, d. 1983. Микроаксиальный игольчатый датчик для полярографического измерения локального давления 02 в клеточном диапазоне живой ткани. Его конструкция и свойства, в: gnaiger, e. Forstner, h. (Eds.), Polarographic oxygen sensors. Springer, berlin, heidelberg, new york, pp. 37-65. Benfante, r. 1992. Исследования сердечно-сосудистых заболеваний и тенденций смертности по конкретным причинам у американских мужчин японского происхождения, проживающих на гавайях, и сравнение факторов риска с другими японскими популяциями в тихоокеанском регионе: обзор. Human biology 64, 791-805. Boushel, r. Gnaiger, e. Schjerling, p. Skovbro, m. Kraunsoe, r. Dela, f. 2007. Пациенты с диабетом 2 типа имеют нормальную функцию митохондрий в скелетных мышцах. Diabetologia 50, 790-796. Brand, m.D. 2000. Uncoupling to survive? Роль неэффективности митохондрий встарении. Экспериментальная геронтология 35, 811-820. Brand, m.D. Nicholls, d.G. 2011. Оценка митохондриальной дисфункции в клетках. Biochem. J. 435, 297-312. Brealey, d. Brand, m. Hargreaves, i. Heales, s. Land, j. Smolenski, r. Davies, n.A. Cooper, c.E. Singer, m. 2002. Ассоциация между митохондриальной дисфункцией и тяжестью и исходом септического шока. Lancet 360, 219-223. Cesar, j. Diminno, g. Alam, i. Silver, m. Murphy, s. 1987. Метаболизм свободных жирных кислот в плазме крови во время хранения концентратов тромбоцитов для переливания. Transfusion 27, 434-437. Cha, s.H. Fukushima, a. Sakuma, k. Kagawa, y. 2001. Хроническое потребление докозагексаеновой кислоты усиливает экспрессию гена белка, не связывающегося с клетками, 3 и влияет на уровни плейотропных мрнк в скелетных мышцах пожилых мышей c57bl/6njcl. The journal of nutrition 131, 2636-2642. Cocco, t. Sgobbo, p. Clemente, m. Lopriore, v. Grattagliano, i. Di paola, m. Villani, g. 2005. Тканеспецифические изменения функций митохондрий у пожилых крыс: влияние длительной диетической обработки n-ацетилцистеином. Free radic biol med 38, 796-805. Darnold, j.R. Vorbeck, ml. Martin, a.P. 1990. Влияние старения на путь окислительного фосфорилирования. Mech ageing dev 53,157-167. Davis, l.M. Rho, j.M. Sullivan, p.G. 2008. Ucp-опосредованное расцепление свободных жирных кислот в изолированных митохондриях коры головного мозга голодающих животных: корреляции с диетическими модуляциями. Epilepsia 49 suppl 8, 117-119. Ferreira, i.L. Resende, r. Ferreiro, e. Rego, a.C. Pereira, c.F. 2010. Множественные дефекты энергетического метаболизма при болезни альцгеймера. Curr drug targets 11, 1193-1206. Gnaiger, e. 2009. Мощность окислительного фосфорилирования в скелетных мышцах человека: новые перспективы митохондриальной физиологии. Int j biochem cell biol 41,18371845. Gnaiger, e. Kuznetsov, a.V. Lassnig, b. Fuchs, a. Reck, m. 1998. Высокоразрешающая респирометрия - оптимальная пермеабилизация клеточной мембраны дигитонином, in: larsson, c, plhlman, l.-L, gustafsson, l. (Eds.), Biothermokinetics in the post genomic era, chalmers reproservice, goteborg, pp. 85-95. Gnaiger, e. Kuznetsov, a.V. Schneeberger, s. Seller, r. Brandacher, g. Steurer, w. Margreiter, r. 2000. Митохондрии в холоде. В: heldmaier, g. Klingenspor, m. (Eds.), Life in the cold. Springer, heidelberg, berlin, new york, pp. 431-442. Haas, r.H. Parikh, s. Falk, m.J. Saneto, r.P. Wolf, n.I. Darin, n. Wong, l.J. Cohen, b.H. Naviaux, r.K. 2008. Углубленная оценка подозрения на митохондриальное заболевание. Mol genet metab 94,16-37. Hauptmann, s. Keil, u. Scherping, i. Bonert, a. Eckert, a. Muller, w.E. 2006. Митохондриальная дисфункция при спорадической и генетической болезни альцгеймера. Experimental gerontology 41, 668-673. Hutter, e. Unterluggauer, h. Garedew, a. Jansen-durr, p. Gnaiger, e. 2006. Респирометрия высокого разрешения - современный инструмент в исследованиях старения. Experimental gerontology 41,103-109. Johannsen, d.L. Ravussin, e. 2010. Ожирение у пожилых людей: виноват ли в этом неправильный метаболизм? Aging health 6,159-167. Kilkson, h. Holme, s. Murphy, s. 1984. Метаболизм тромбоцитов при хранении концентратов тромбоцитов при 22 градусах с. Blood 64, 406-414. Kitchens, c.S. Newcomb, t.F. 1968. Дыхание тромбоцитов человека. J appl physiol 25, 581-585. Kones, r. 2010. Болезнь паркинсона: молекулярная патология митохондрий, воспаление, статины и лечебное нейропротекторное питание. Nutr clin pract 25, 371-389. Krige, d. Carroll, m.T. Cooper, j.M. Marsden, cd. Schapira, a.H. 1992. Тромбоцитарная митохондриальная функция при болезни паркинсона. The royal kings and queens parkinson disease research group. Ann neurol 32, 782-788. Kuznetsov, a.V. Strobl, d. Ruttmann, e. Konigsrainer, a. Margreiter, r. Gnaiger, e. 2002. Оценка дыхательной функции митохондрий в малых биоптатах печени. Anal biochem 305,186-194. Lemieux, h. Semsroth, s. Antretter, h. Hofer, d. Gnaiger, e. 2011. Митохондриальный контроль дыхания и ранние дефекты окислительного фосфорилирования в отказывающем человеческом сердце. Intj biochem cell biol 43,1729-1738. Lenaz, g. Genova, m.L. 2009. Структурно-функциональная организация митохондриальной дыхательной цепи: динамическая суперсборка. Int j biochem cell biol 41,1750-1772. Lesnefsky, e.J. Hoppel, c.L, 2006. Окислительное фосфорилирование и старение. Старение исследовательские обзоры 5, 402-433. Merlo pich, m. Bovina, c, formiggini, g. Cometti, g.G. Ghelli, a. Parenti castelli, g. Genova, m.L. Marchetti, m. Semeraro, s. Lenaz, g. 1996. Ингибиторная чувствительность дыхательного комплекса i в тромбоцитах человека: возможный биомаркер старения. Febs lett 380,176-178. Nicholls, d.G. 1977. Эффективная протонная проводимость внутренней мембраны митохондрий из коричневой жировой ткани. Зависимость от градиента протонного электрохимического потенциала. Eur j biochem 77, 349-356. Nulton-persson, a.C. Szweda, l.I. 2001. Модуляция митохондриальной функции перекисью водорода. The journal of biological chemistry 276, 23357-23361. Picard, m. Taivassalo, t. Gouspillou, g. Hepple, r.T. 2011. Mitochondria: isolation, structure and function. J physiol. Rasmussen, u.F. Krustrup, p. Kjaer, m. Rasmussen, h.N. 2003a. Экспериментальные доказательства против митохондриальной теории старения. Исследование изолированных митохондрий скелетных мышц человека. Экспериментальная геронтология 38, 877-886. Rasmussen, u.F. Krustrup, p. Kjaer, m. Rasmussen, h.N. 2003b. Митохондриальный метаболизм скелетных мышц человека в молодости и в старческом возрасте: отсутствие признаков функциональных изменений в образовании атф и окислительной способности митохондрий. Pflugers archiv : european journal of physiology 446, 270-278. Rosenstock, t.R. Duarte, a.I. Rego, a.C. 2010. Митохондриально-ассоциированные метаболические изменения и нейродегенерация при болезни хантингтона - от клинических признаков к лабораторным исследованиям. Curr drug targets 11,1218-1236. Rossignol, r. Faustin, b. Rocher, c, malgat, m. Mazat, j.P. Letellier, t. 2003. Пороговые эффекты митохондрий. Biochem j 370, 751-762. Sjovall, f. Morota, s. Hansson, m.J. Friberg, h. Gnaiger, e. Elmer, e. 2010. Сепсис вызывает расцепление митохондрий тромбоцитов и постепенное увеличение дыхательной емкости, что отрицательно связано с клиническим исходом. Critical care 14, p:ll. Tonkonogi, m. Fernstrom, m. Walsh, b. Ji, l.L. Rooyackers, o. Hammarqvist, f. Wernerman, j. Sahlin, k. 2003. Снижение окислительной мощности, но неизменная антиоксидантная способность в скелетных мышцах пожилых людей. Pflugers archiv : european journal of physiology 446, 261-269. Vendelbo, m.H. Nair, k.S. 2011. Митохондриальные пути долголетия. Biochimica et biophysica acta 1813, 634-644. Xu, j. Shi, c, li, q. Wu, j. Forster, e.L, yew, d.T. 2007. Митохондриальная дисфункция в тромбоцитах и гиппокампе мышей с ускоренным старением. J bioenerg biomembr39,195-202. Yamori, y. 2006. Пищевые факторы для профилактики атеросклероза: азиатская перспектива на основе анализа мировых диетических биомаркеров. Экспериментальная иклиническая кардиология 11, 94-98. Yanicostas, c, soussi-yanicostas, n. El-khoury, r. Benit, p. Rustin, p. 2011. Developmental aspects of respiratory chain from fetus to infancy. Seminars in fetal & neonatal medicine 16,175-180. Если у вас есть вопросы о том, где и как использовать [[https://dnpshop.top|днп заказать]], вы можете обратиться к нам на веб-страницу.